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酶工程 人事经理的转基因工程 周易本义卦歌 转基因

嫩肉粉

weixingdazai卫星搭载

大约一个月前,苏珊告诉我,她在阿富汗吃到了一种很特别的牛肉。我就问她,是不是那种喝朝日啤酒,听魔扎特音乐的牛身上的肉。她知道我在取笑她,感觉有几分委屈。我看她不高兴,便把话题扯开了。我问她去阿富汗做什么,她说她去那里当志愿者,于是又把话题转到了牛肉。瞧,我是多么 的笨嘴拙舌!

“那个牛肉确实很特别,不但嫩,而且有一股Bordeaux(波尔多)......”苏珊是我在家乐福的同事,在法国读的工商管理。苏珊能够讲一口流利的中文,虽然不能像我一样讲100%的中文,但是她总喜欢用法语替代那些有中文翻译的专有名词,比如,她从来不说“波尔多”,而总是说“Bordeaux”。当然她的法语发音很纯正,而且已经解决了小舌颤音等中国人生理上讲很难解决的问题。尽管如此,我还是希望她能够讲100%的中文,我的想法她也知道。听到她又说Bordeaux,我便打断了她。

“我还以为是朝日啤酒,原来是法国红酒。”

“是波-尔-多,tu es content? 而且啊,还有一种圣-马塞兰的清香......”

“吃牛肉还吃出兰花味来了。”我本以为这话接得很机智,很幽默。可是话一说出我就后悔了。我知道我给了她一个说“夹生”法语的机会。

“不是兰花的兰,是 Saint-Marce-lin, lin, lin, lin。”苏珊知道我这个南方人发不好法语的鼻化元音,便一连说了4个“lin”。

圣-马塞兰是一种法国奶酪。苏珊的描述让我想起了一个老朋友,大卫。大卫是个美国人,在越南开一个牛肉餐馆,招牌菜自然就是牛肉。我记得大卫的餐馆的牛肉就很嫩而且有一股奶酪味。我问过大卫,他告诉我,牛肉很嫩是因为在里面添加了菠萝。奶酪味是因为里面放了榴莲。大卫告诉我他的生意很好。在越南,牛的品种都一般,所以没有本身就很嫩的牛肉。越南人不知道往里面加菠萝,所以他们做不出像我这样嫩的牛肉。而且越南曾经是法国的殖民地,他们喜欢奶酪,又不敢明说,我在牛肉里加榴莲真是恰到好处。

大卫很聪明,很有经济头脑。他中学没有毕业就去越南参加战争,战后他就留在了越南,开他的牛肉餐馆。

“想什么呢?”苏珊问。

“哦,你在阿富汗呢,我去了越南。”

“我不我们找个时间去一次阿富汗?我请你吃牛肉。”苏珊知道我说的去了越南是对我走神的解释。

所以我们在上个周末就去了阿富汗。当我们走进那家牛肉餐馆的时候,我惊呆了。我看见了我的老朋友:大卫。

“大卫,是你吗?你怎么变得这么老啊?!”见到老朋友的欣喜让我口不择言。

“在美国,我们都是说‘你越来越年轻了’。”大卫一点都没有改变他的美国幽默,只是他老得快让我认不出了。

“你当然是老多了,老得都快让我认不出了。要不是你门口那招牌,我还真不敢认你。你门口那招牌也老了,油漆都掉了。”

"Il faut vieillir ou mourir jeune." 我对着苏珊说了一句法国谚语。

“啊,这位小姐我们上个月见过,你比上个月更漂亮了,更年轻了。”

不久我们便吃上了大卫的嫩牛肉,同时有红酒和奶酪的风味。我知道阿富汗产罂粟不产菠萝。想到这里我便产生一种晕乎乎飘飘然的感觉。忍不住我立即问大卫:

“你的牛肉怎么这么嫩,还有红酒和奶酪味?”

“菠萝和榴莲,越南进口的。先吃吧,吃完我带你转转,参观一下我的餐馆。”

这牛肉的味道还真是不错,就是不知道大卫在里面加了什么东西,吃得十分不踏实。吃完饭,大卫带着我们参观了他的餐馆,详细地给我介绍了他的嫩肉粉。内容太多,我也就记得个大概,全写在下面了。

我们知道,肌肉组织中含有胶原蛋白,胶原蛋白是一种纤维蛋白,这种蛋白质的分子中由于存在着交联键而使肌肉具有很强的机械强度。交联键分为两种:一种具有耐热的特性;另一种具有不耐热的特性。 幼小畜禽肌肉中的胶原蛋白里不耐热的交联键比较多,这种交联键一经加热就会断裂,所以,幼小畜禽的肌肉烹调后很容易软化。 而年老畜禽肌肉中的胶原蛋白里耐热的交联键比较多,这种交联键经过加热不易断裂,所以,年老畜禽的肌肉烹调后不容易软化。

用嫩肉粉处理年老畜禽的肌肉(通常是将嫩肉粉的浆液涂抹在肉块的表面或浸泡肉块),可以使这类肌肉中的胶原蛋白水解,使肌肉变软并且易于烹调。

嫩肉粉的主要成分为蛋白酶,因此要了解嫩肉粉,首先便要了解酶。酶是生物体产生的具有催化功能的蛋白质,它能将结构复杂的分子分解为生物自身能消化吸收的小单位分子。如同将一幢大楼拆解为一块块砖头,汽车才能搬运一样。而“酶”就是“拆楼工人”。酶具有两个特性,一:效率高,分解速度快。二:专一性,不同类型的酶分解不同的物质,比如蛋白酶只分解蛋白质,淀粉酶只分解淀粉。这就如拆迁中有人只负责拆除墙壁,有人只负责拆窗户一样。

肉类制品进入人体主要由胃分泌的胃蛋白酶和胰腺产生的胰蛋白酶将肉类中的蛋白质分解为小单位的肽类和氨基酸等。嫩肉粉中蛋白酶的作用原理与胃蛋白酶和胰蛋白酶作用原理完全相同,只是嫩肉粉中蛋白酶的来源不同,一是动物体内,一是植物体内。目前蛋白酶的提取多源于植物性原料,如木瓜、生姜、菠萝等。其命名一般都是根据提取原料而定,如从生姜中提取的,就叫生姜蛋白酶,从木瓜中提取的叫木瓜蛋白酶。以时下嫩肉粉中常用的木瓜蛋白酶为例,其加工工艺便是将未成熟的木瓜果实割口,收集其乳汁,然后通过一系列加工得到木瓜蛋白酶,再添加一定比例的其他辅助剂,即制成了嫩肉粉。据《食品添加剂手册》介绍,肉类嫩化剂配方为2%木瓜蛋白酶,15%葡萄糖,2%味精及食盐等。 大卫在越南做牛肉的时候放菠萝就是因为菠萝里面有蛋白酶,菠萝蛋白酶。

大卫告诉我,随着东盟自由贸易区的建立,越南的菠萝被大量出口到中国,虽然他还可以把牛肉做得很嫩,但是顾客习惯于在他的牛肉里吃到菠萝,但是又没有菠萝,所以他的生意在越南不好做了,便来到了阿富汗。大卫说他现在在阿富汗卖的牛肉里面放入了嫩肉粉,主要成分是蛋白酶,不过不是从菠萝里提取的,而是通过改造菌种,所以他现在的牛肉不但嫩,而且同时有红酒和奶酪味。大卫说得津津有道,我又对这位只有中学文化的美国人增加了几分佩服。美国人的动手能力就是强。

能够生产蛋白酶的微生物菌株很多:黑曲霉、米曲霉、方斋藤曲霉(Aspe—rgillnsaitoi)、泡盛曲霉、宇佐美曲霉(Aspergillususamii)、金黄曲霉、栖土曲霉、乾氏曲霉、中泽曲霉、白宇佐美曲霉、白曲霉、杜勃曲霉、沙门柏干酪青霉、微紫青霉、篓地青霉、丛簇青霉、拟青霉、米黑毛霉、微小毛霉、德氏根霉、华氏根霉、少孢根霉、栗疫菌、小孢根霉、血红栓菌、乳白耙菌、啤酒酵母、黏红酵母、白假丝酵母、乳酸杆菌、枯草杆菌等 等,等等。

大卫说这里有一个关键的技术,那就是菌种改良,提高酶产量,改变酶性能。于是又跟我们说起了他跟美国军方关系如何密切,他有一个朋友参与过731项目,等等,等等。

我用法语对苏珊说:“这老家伙又开始吹牛了。他没什么毛病,就是好吹牛。从越南吹倒阿富汗了,他要真跟美国军方有哪怕是那么一小点的关系,也不至于在阿富汗卖牛肉啊。菌种培养,DNA片段截取都是初中的实验项目。跟731啥关系都没有啊!”

“你说我坏话呢?”大卫说。

苏珊还真是一个实在人,一听这话就脸红了。

"Quand on rougit, ça signifie 'oui', n'est-ce pas?"

这回,该轮到我脸红了。大卫什么时候学会法语的?

“士别三日,当刮目相看,”大卫仿佛看出了我的疑惑。

“菌种培养,DNA片段截取真的都是中学的实验项目。”硬着头皮,我只好跟他解释。我身上正好带着一本高中二年级第一学期的课本,我便打开,跟大卫作了一个介绍:

  (二)发酵工艺
  1.发酵培养基 产酸性蛋白酶的微生物,它们的发酵培养基都基本选择麸皮、米糠、玉米粉、淀粉、饲料鱼粉、豆饼粉、玉米浆等各种碳氮源,按各种不同比例混合,添加无机盐配成各种培养基。下面列出的是黑曲霉3.350发酵培养基的配方:
  豆饼粉 3.75% 玉米粉0.625%
  鱼粉 0.625% 氯化铵 1.0%
  氯化钙 0.5% 磷酸二氢钠0.2%
  豆饼石灰水解液10% pH 5.5
  2.培养条件对产酶的影响 接种量:适当控制接种量对菌株产酸性蛋白酶的活力关系很大。通过对宇佐美曲霉537的研究,表明5%的接种量比10%的接种量要好。
  3.pH 对于生产酸性蛋白酶的菌株来说,培养基的起始pH对其产量有较大的影响。不同的菌种对起始pH的要求也各有不同:斋藤曲霉为pH5.5;微紫青霉为pH3.0;根霉为pH4.0;黑曲霉3.350为pH5.5;肉桂色曲霉NO.81为pH4.5—6.0。
  4.温度 酸性蛋白酶的生产,对于温度的变化很敏感。黑曲霉正常发酵采用30C,斋藤曲霉采用35C,根霉和微紫青霉采用25 。
  5.通风量 通风量较大对产酸性蛋白酶有利,但通风量对产酶的影响还因培养基和菌种不同而异。宇佐美曲霉变异株537,其对通风量要求较高,在发酵前期风量不宜过大,过大反而不利产酶,但在发酵后期48h以后,风量应控制在1:0.8—1:1之间,这样平均每6h,酶活力可上升600—800单位。通风气量不足对黑曲霉菌丝体的生长无明显影响,但对酶产量有严重的影响。
  6.氧载体 在发酵过程中,在发酵培养基中加入正十二烷、全氟化碳,液态烷烃(为12—16碳直链烷烃混合物)等氧载体,使培养基中氧传递速度加快,产生气泡少,剪切力小,能明显提高菌株产酸性蛋白酶的量。
  (三)酸性蛋白酶提取工艺
  酸性蛋白酶生产的最后一道工艺就是提取,提取的方法主要有沉淀结晶法和离子交换柱层析法,下面以斋藤曲霉酸性蛋白酶的提纯为例具体说明。
  1.沉淀结晶法
  沉淀结晶法提取酸性蛋白酶工艺流程
  2.离子交换柱层析法 该法使用弱酸性阳离子交换树脂,例如粗孔型的AmberliteIRCXE—64、CG-10、DuoliteCSl01等吸附。
  将DuoliteCSl01树脂(110~117目)装入3craX70cm柱中,将溶于M/10的醋酸钠一盐酸(pH3.5)缓冲液的斋藤曲霉酸性蛋白酶粗酶液通过柱子,控制流量为每小时30ral,收集流出液每份lOml,测定酶活性和蛋白质含量(用Folin法或紫外分光度法),然后用水或M/50醋酸钠一盐酸(pH3.55)缓冲液洗柱,淀粉酶首先洗脱,然后用水M/2醋酸钠一盐酸(pH5.2)缓冲液洗柱,蛋白酶的收率为60%~70%,经过盐析,丙酮结晶,收率高于沉淀结晶法。
  为了除去酶液中的色素,在DuolitCSl01树脂处理前先在pH3.2下,用Deowex-1树脂(用M/10醋酸钠一盐酸缓冲液平衡,pH2.8—3.0)处理,蛋白酶活性损失仅10%。 发酵与酿造的工艺过程,主要包括把菌种活化与扩大培养,发酵与酿造原料、发酵与酿造前处理及培养基制备,以及下游加工技术如发酵液的预处理与分离,发酵料初步纯化、高度纯化和成品加工等知识。

我简单地把内容用英语给大卫解释了一下,又往后翻了两页:

一、菌体

工业生产的微生物体,可分为二种。一种是供制备面包用的酵母;另一种是作为人类或动物的食物的微生物细胞(单细胞蛋白质)。早在1900年时,面包酵母已经形成大生产的规模。作为人类食物的酵母生产,则是在第一次世界大战时在德国发展起来的。作为食用蛋白质来源的微生物细胞的生产,直到1960年才作深入的研究。

二、微生物的酶

工业上,曾由植物、动物和微生物生产酶。微生物的酶可以用发酵技术大量生产,是其最大的优点。而且与植物或动物相比,改进微生物的生产能力也方便得多。关于微生物的酶的应用,列表总结于下表。从表中可以看出微生物的酶主要应用于食品及其有关工业中。酶的生产是受到微生物本身严格控制。为改进酶的生产能力可以改变这些控制,如在培养基中加入诱导物和采用菌株的诱变和筛选技术,以消除反馈阻遏作用。

近半人世纪以来,提纯结晶的酶制剂已在百种以上。例如,广泛用于食品加工、纤维脱浆、葡萄糖生产的淀粉酶就是一种最常用的酶制剂,其他如可用于澄清果汁、精炼植物纤维的果胶酶,以及在皮革加工,饲料添加剂等方面用途广泛的蛋白酶等,都是在工业和医药上十分重要的酶制剂。此外,还有一些在医疗上作为诊断试剂或分析试剂用的特殊晦制剂也在深入研究和应用。

三、微生物代谢产物

微生物的生长过程,可分为几个阶段。向培养基中接种菌种后,并不立即开始生长,可能是个适应时期,这个阶段称为延缓期。然后细胞的生长率逐渐增加,而达到最大生长率,并成为一个常数,这时称为对数成长期。接着细胞生长停滞进入所谓稳定期。随后,活细胞数下降,培养液进入死亡期。除以动力学描述微生物的生长外,还可以按生长曲线中不同时期所产生的产物来分期。在对数生长期中,所产生的产物,主要是供给细胞生长的物质,入氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。这些产物称为初级代谢产物。能产生这些物质的生长阶段(相当于对数期)称为营养期(Trophophase)。

利用发酵生产的许多初级代谢产物,具有重大的经济意义,列表总结于下表中。野生型的微生物所产生的初级代谢产物,只限于微生物本身的需要。工业微生物学家的任务是改良野生型微生物并改善培养条件,以增进这些化合物的生产能力。

我又把书往后翻了两页:

酶的分离纯化方法简介

生物细胞产生的酶有两类:一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶,称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶,如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶,就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高,容易得到;另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外,而在细胞内起催化作用,称为细胞内酶,如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应,就是在多种酶催化下在细胞内进行的,在类酶在细胞内往往与细胞结构结合,有一定的分布区域,催化的反应具有一定的顺序性,使许多反应能有条不紊地进行。

酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的,但每一种酶的含量却很低,如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多,但各种酶的含量却差别很大。

因此,在提取某一种酶时,首先应当根据需要,选择含此酶最丰富的材料,如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制,如不能综合利用,成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多,既不受气候地理条件限制,而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到,微生物繁殖快,产酶量又丰富,还可以通过选育菌种来提高产量,用廉价原料可以大量生产。

由于在生物组织中,除了我们所需要的某一种酶之外,往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质,因此为制取某酶制剂时,必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质,蛋白质很容易变性,所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱,保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标,在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤,始终要测定酶的总活力和比活力,这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶,纯度提高了多少,从而决定着一步骤的取舍。

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤:即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液,此时不可避免地夹带着一些杂质,然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来,或者从此溶液中选择性地除去杂质,然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍:

一、预处理及固液分离技术

1.细胞破碎(cell disruption)

高压均质器法:此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中,菌体从高压环境转到低压环境,细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率,起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力,减少操作次数。但有人报道,当操作压力达到175Mpa时,破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时,细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门,尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。
容菌酶处理法:蛋清中含有丰富的溶菌酶,价格便宜,常用来裂解细胞。具体做法是:溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg,置于0.5%的氯化钠溶液中,使细胞浓度为5%(干重),在35℃用0.68kg(干重)的蛋清处理20min,得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理,用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去,再将乙醇浓度提高到75%(体积分数),可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。

2.离心

离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型,所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔,壁上有过滤介质,一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离,如发酵液中的菌体,用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。
在生物领域采用的离心机系统,除了应具备离心机的一般要求外,还应满足生物生产的技术要求,这包括灭菌、冷却、密封,以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤,并进行程序控制:离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置,具有双重轴向密封,密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成,密封由水连续冷却和润滑,可防止产品被污染,也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器,可在121℃温度下进行蒸汽灭菌,该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套,对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却,并能有效地控制温度,这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离,可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善,如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。

3.膜分离技术

在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜,使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜,而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径,而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的优点是:操作条件温和,无相变化,对生物活性物质没有破坏。

超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成,料液经泵打入超滤器,水及低分子量物质排出超滤器外,被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。

超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题:第一,在超滤循环过程中,由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用,料液的温度会逐渐升高,会造成蛋白质分子的损失。因此,料液贮罐应加冷却系统,并安装自动测温及控制系统。第二,某些酶的辅助因子散失为问题:一些酶含有辅助因子,其分子量小,超滤时易从透过液中排除掉,因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。

还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其工作原理是:当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时,如果在膜的一侧结合着亲和配基,该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来,洗脱液用于进一步的分离纯化。

4.泡沫分离

原理:将气体通入含多种组分的溶液中,由于这些组分的表面活性由差异,因此在溶液的表面,某些组分将形成泡沫,泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多的表面活性成分,故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。这样,溶液中的组分舅得以分离。

蛋白质较易吸附与气液界面,这有利于其结构的稳定。泡沫分离过程是:蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面,该过程可能是可逆的也可能是不可逆的;分子发生重排,一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜,一种是稀膜,另一种是浓膜,可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以是多层的。膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。

泡沫分离的目的,一方面提高酶蛋白的富集率(泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度),另一方面提高酶蛋白的提取率(泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量),或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。

二、抽提

沉淀

1. 盐析

常用的盐析剂是硫酸铵,其溶解度大、价格便宜。硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强,其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。
pH的控制:应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑,在酶等电点时其溶解度最小易沉淀,但有些酶再等电点时稳定性较差,因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦确定最佳pH值后,在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值,要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌,并注意硫酸铵的加入速度,一般是由少到多,缓慢加入,硫酸铵尽可能磨成细粉。

温度的控制:有些酶在较高温度下稳定性能较好,可在常温下进行盐析操作,而对于大多数酶,尽可能在低温下操作。

酶液的净置:加完硫酸铵后,酶液要静置一段时间,使酶蛋白完全沉淀下来,酶静置后,就不要再加以搅拌。

2.有机溶剂沉淀

有机溶剂选择:可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等,如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能较好,可防止蛋白质的变性,酶蛋白在其中的溶解度也较低。

有机溶剂沉淀操作:有机溶剂一般都使蛋白质变性,当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。因此用有机溶剂处理时最好在0℃以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久,要尽快加水溶解。

3.聚合物絮凝剂沉淀

聚合物絮凝剂,如葡聚糖和聚乙二醇,与酶分子争夺水分子,具有脱水作用使酶沉淀。聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中,其浓度可达到50%,浓度为6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。这种试剂不需要低温操作,而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。聚乙二醇不会被吸附,故在离子交换吸附前不必去除。

4.用金属离子和络合物沉淀

酶和其他蛋白质都会形成金属盐,其溶解度较低。用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相互作用后,可逆变化较差,尤其是用巯基衍生物,它结合的]金属离子会催化酶变性而失活。

5.用特殊试剂沉淀法

用链霉素可选择性去除核酸,从而使胞内酶沉淀出来。链霉素盐(浓度为0.5-1.0mg/mg蛋白质)对于选择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好,酶不易失活。

6.亲和沉淀

将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成了亲和沉淀技术。将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物,该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出来。

配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合,溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大,只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力,甚至使亲和结合发生逆转。

引导产生沉淀的方法有:离子交联;加入带相反电荷的聚合物;加入带相反电荷的疏水基团;改变pH值,诱导产生疏水沉淀;温度诱导产生沉淀。

亲和结合:将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中,调节好有关沉淀的条件,使之有利于亲和结合。

洗涤:为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合,尤其是使用带电的聚合物,离子交换的效应将使其他蛋白质共同沉淀,因此在分离目的物之前要洗涤沉淀物。其做法是:加入适当的清洗剂重新溶解沉淀,再沉淀;或在专一性洗脱之前,彻底清洗沉淀。在上述过程中要始终保持目的蛋白质与配基处于亲和结合状态。

配基-载体复合物与目的蛋白质的分离:分离结束之后,要确保回收目的蛋白质和配基-载体复合物,目的蛋白质要达到一定的纯度,回收率要高。

我一边往后翻着书,一边用简单的英语给大卫介绍着。

“你把你刚才说的DNA片段截取的内容给我找出来。”

我已经把书翻到快最后了,这时候我想起,那个DNA片段截取的实验,是一个课外实验,不是中学生物教学大纲要求的内容。这回我脸红了。

"Quand on rougit, ça signifie 'oui', n'est-ce pas?"

这给了我一个台阶,我趁机转移话题,我就问:“大卫,你什么时候学的法语啊?”

大卫跟我介绍了我们上一次见面以后的一些情况和他以后的打算。

大卫在越南的餐馆的牛肉歪打正着,又嫩,又有奶酪味。所以他就开始研究奶酪。同时他又不甘心一直做一个小餐馆,所以也就常看一些法国餐饮的书,很自然就把法语学会了。后来菠萝越来越少,他就尝试用菠萝叶、菠萝树枝提取菠萝蛋白酶。在一个朋友的帮助下,他成功的改良了几个菌种,现在他生产的酶加在他的嫩肉粉里面,能够使得他的牛肉有各种不同的风味。他正在法国申请专利同时计划在法国上市。

“那你为什么没有在法国,而是在阿富汗呆着呢。”苏珊问。

“我有一些朋友在这里。”

也许是他真的有一些朋友在阿富汗,也许是别的原因,我们没有多问。临别,大卫还要送我们一些他的嫩肉粉,我们没有要,因为阿富汗似乎产毒品,我们可不想带两包粉末从阿富汗回过。

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